將膠浸泡在0.5ⅹTBE大約 10min 。

用EtBr （0.5ug/ml）染膠10min 后，用紫外凝膠觀測RNA電泳情況（參考Ambion公司的條帶分析）。用0.5ⅹTBE 洗膠 5min.

用鉛筆標記好轉膜的面，將 Nylon membrane（GE公司）和兩片厚濾紙浸泡在 0.5ⅹTBE 大約10min.

制備凝膠、膜夾層。將濾紙、膠、膜、濾紙形成三明治結構，注意膠應該靠近陰極側。注意每層間不能有氣泡。

裝配好轉膜裝置，裝置同Western Blotting轉膜裝置。

于冰上300mA轉膜 1 h。

把膜（RNA 面朝上）放在紫外交聯儀中使用4000J UV進行交聯.

將膜夾在厚的濾紙中間，80℃烘烤0.5-2 h，可以輕壓，以防止膜發生翻卷。

如果可以直接做，則放在室溫即可；也可以儲存在4oC ，直到使用（可儲存6個月）。

亞甲藍（methylene blue）染色 3~5min, 在可見光下 黃色濾光片對膜照相。

7.雜交

在雜交爐中37- 42℃ 在雜交液（7% SDS， 0.2M Na2HPO4）中預雜交1h , 然后將膜放入雜交袋，然后加入配好濃度的Dig-Labeled probe，在雜交爐中37- 42℃雜交過夜。Dig-Labeled probe使用濃度：將10ul的25uM的公司原液稀釋十倍后分裝儲存，取儲存probe液（2.5uM）20ul/6ml（U6內參）或2.7-27ul儲存液/10ml雜交液（根據miRNA的量或豐度定）。

37- 42℃洗膜液（2×SSC，0.1%SDS）洗膜三次，每次15min。

室溫MABT（0.1M Maleic Acid， 0.15M Nacl，0.3% Tween-20 ，PH7.5）洗膜三次，每次5min。

室溫用Blocking Solution（用MAB 10倍稀釋10×Blocking Solution）封閉 1h 。

室溫加入anti-Dig antibody 40 min（1:10000-1:5000 in Blocking Solution）。注意：抗體用之前，應該以12000g速度離心5 min。

用MABT液洗膜兩次，每次15 min。

膜在Detection buffer（ 0.1 M Tris-HCl, 0.1M NaCl, pH 9.5）中平衡5 min。

配CSPD液（1：100 Detection Buffer），有RNA的膜面向上放入雜交袋中，加入1ml 配好的CSPD液，擠出氣泡，封口，孵育5 min。

擠出CSPD液，封口，37℃孵育5-15 min。

曝光2 min~1h（根據情況定）。一般內參U6在5分鐘內即可顯影。

實驗注意事項

配膠時，由于濃度較大，所以尿素比較難溶，尿素的溶解不能加熱，可以采用振蕩或顛倒離心管；配好的無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠可以儲存在室溫或4℃冰箱中（可儲存1個月左右）。

電泳前，應該按照步驟將裝置盡量進行RNAase free處理。

RNA上樣前，300V 預電泳10min（防止膠漏，同時活化膠），然后用電泳液1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。此操作需要一定的訓練，因為加樣孔中很快會析出尿素，一旦有尿素析出對RNA電泳的形態會有一定的影響。

LNA探針使用前進行分裝，然后凍存于-70℃冰箱中。

不同miRNA雜交的溫度和時間不同，需要進行條件的摸索。一般內參溫度為42℃。

尼龍膜紫外交聯和烘烤后，可以在4℃冰箱中保存半年以上。

三、miRNA靶基因的鑒定

由于計算機模擬在預測miRNA靶基因時存在一定的局限性,利用生物學實驗方法可以更加直觀地尋找miRNA靶基因.目前主要是從mRNA水平與蛋白質水平來尋找靶基因。從mRAN水平來尋找靶基因主要是通來在細胞內過表達miRNA后，利用基因芯片分析mRNA的變化以找出相應miRNA的靶基因。這種方法由于miRNA所介導的轉錄后翻譯抑制過程不引起mRNA水平的改變, 因此依據mRNA水平的變化尋找miRNA靶基因的方法在檢出率上存在一定問題。 故采用蛋白質質譜的方法可以有效彌補這個不足。同時再結合miRNA靶基因的預測方法，可以大大提高了靶基因的檢出率及可靠性。

目前鑒定靶基因最直接的方法是, 利用熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測轉染或敲低miRNA后細胞中mRNA水平及蛋白水平的變化, 從而確定miRNA與靶基因的對應關系。 這種方法可以大大提高準確率，但最終確定靶基因，還需要鑒定miRNA的靶位點。 而miRNA的靶位點的鑒定最常用的方法是熒光素酶報告基因法。 其基本原理是首先構建熒光素酶表達載體, 將希望鑒定的miRNA靶基因的3′UTR構建到熒光素酶基因的3′UTR中, 然后將熒光素酶基因表達載體轉染細胞并改變細胞中相應miRNA的表達水平, 最后檢測熒光素酶的表達情況以分析轉染3′UTR中是否含有miRNA的靶位點。返回搜狐，查看更多