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microRNA實驗方法

一、概觀miRNA

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼的小RNA分子，通過與靶RNA的3′UTR互補或部分互補結合，使其降解或介導其翻譯抑制，參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發育、腫瘤轉移等多種生物學過程。miRNAs及其衍生物在疾病診斷和治療有很大的前景。 miRNAs基因通常位于基因間或編碼蛋白基因的內含子中，在核內由RNA聚合酶II或III轉錄產生具有特征性莖環結構的pri-miRNA，然后在Drosha-DGCR8復合體的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA，它由exportin5由核內運到胞漿。在胞漿內，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟雙鏈miRNA，其中的一條鏈與RISC結合而參與基因轉錄后水平的調控。

miRBase數據庫第21版里列有來自223物種的28645莖環結構和35828成熟miRNAs。可能近90%的人類基因受到miRNAs調控，然而，當過表達或抑制某一個miRNA時，在發生調變的眾多基因當中尋找并鑒定其中起關鍵作用的靶基因仍然具有相當大的挑戰。目前鑒定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息學軟件預測，結合基因芯片分析以及生物學實驗方法來研究miRNA的功能及尋找其中起重要作用的靶基因。此外，利用蛋白質質譜來尋找miRNA靶基因也成為一種新的途徑。

二、miRNA的檢測和定量

為了驗證miRNA在組織細胞內的表達，目前常用來檢測miRNA的技術主要有以下幾種：Northern雜交，原位雜交， Stem-loop實時定量RT－PCR。這三種技術各有利弊，可以相互結合應用，來反映細胞內miRNA的真實表達水平。

Northern雜交

MicroRNA是一類很小的分子，部分microRNA表達水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究有一定困難，特別是重復性較差，步驟繁瑣等。目前多數研究人員采用Northern Blot，它是一種重復性好、靈敏高、直接的方法,可以用來檢測microRNA的存在、表達量的變化等。而由于放射污染等原因，同位素標記的探針的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出的鎖核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）探針，具有穩定性高、特異性好、無放射污染等優點，成為新的Northern Blot檢測探針。

Northern雜交表明從人類和小鼠來的前miR-499和成熟miR-499條帶

基本原理

將待檢測的RNA分子變性后，通過尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離,繼而按其在凝膠中的位置轉移到尼龍膜上，固定后再與同位素、地高辛或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。

用途

檢測樣品中的RNA及其含量，了解基因的狀態, 如是否有點突變、擴增重排等。

實驗過程

1.提前配制無APS和TEMED的15%的Ura-PAGE膠的混合液，即50ml of Pre-Gels：

Urea: 24 g

40% Acrylamide: 18.75 mL

5x TBE Buffer: 10 mL

ddH20: 0 mL

2.器皿的清洗：器皿同Western Blotting裝置。

用清水沖洗干凈，乙醇擦干3%；

H2O2 填充浸泡電泳槽、玻璃片、梳子10分鐘；

用0.1% DEPC處理過的水沖洗電泳槽，梳子和玻璃片。

用RNAase Away 擦海綿和其他相關器材。

安裝配膠裝置。

3.配膠：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混勻，加入玻片中，加入10或15齒梳子。大約30-60 min 即可凝好。

4.RNA樣品的準備 Small RNAs（大約107細胞） （或者Total RNA ~20-200ug） 在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加熱 5min, 冰上冷卻。 瞬時離心收集RNA樣品。

5.電泳：（裝置同Western Blotting電泳裝置），電泳液1xTBE。15% Urea-PAGE 在電泳液 1xTBE進行電泳。電壓180V 直到溴芬蘭到達膠的底部。根據Ambion公司的步驟，在上樣之前，300V 預電泳10min（防止膠漏同時活化膠），然后用電泳液1xTBE沖洗孔，將尿素沖出后然后小心、迅速加樣。選用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作為對照，同時將自己合成的RNA Oligo作為陽性對照（總量為1 pmol即可）。其中 溴芬蘭的對應的分子量為13nt左右，二甲苯青FF對應的為40 nt左右。

6.轉膜（裝置同Western Blotting轉膜裝置），轉膜液為0.5ⅹTBE。